一、一周内容概述

（一）基因工程的基本内容

1、基因工程的概念

　　概念：基因工程又称为基因拼接技术或DNA重组技术。在体外，将外源基因经“剪切”和“拼接”重组后，导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物或创建新的生物类型。

　　作用：定向改造生物的遗传性状。

2、基因操作的工具

　　基因的剪刀——限制性内切酶：能识别一种特定的核苷酸序列，并能在特定的切点上切割DNA分子。

　　基因的针线——DNA连接酶：连接被限制酶切开形成的粘性末端，合成重组的DNA分子。

　　基因的运载工具——运载体：常使用的有质粒、噬菌体和动植物病毒。具备条件：能在宿主细胞中复制并稳定存在；具多个限制酶切点；具某些标记基因，便于筛选。

3、基因操作的基本步骤

二、重、难点知识归纳及讲解

（一）限制性内切酶——切割工具

1、概念

　　在生物体内有一类酶，它们能将外来的 DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。主要存在于微生物中，现已发现的有200多种。

2、切割特点——具极好的专一性

　　每一种限制性内切酶只能识别一种核苷酸序列，在特定的切点上切割DNA分子形成两个完全相同的黏性末端（切割后产生的具有碱基互补单链的末端）。两个具相同的黏性末端的异源DNA分子可以通过其黏性末端黏合在一起。

（二）基因的运载工具——运载体

　　目的基因片段很难直接转入生物体细胞，而且由于它自身常无DNA复制所需的信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，所以人们要把它连在运载体上。

　　运载体是基因的运输工具，在基因操作过程中，使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

　　因此作为运载体必须具备三个条件：

　　（1）能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；

　　（2）有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；

　　（3）具有某些标记基因，以便进行筛选。

　　目前，基因工程经常使用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是细菌染色体DNA以外的小型环状DNA（一般有1—200Kb，Kb为千碱基对），有的细菌只有一个，有的细菌有多个；另一类是噬菌体和某些病毒的DNA。PBR322是人工改造的大肠杆菌质粒，它可以独立复制，也可整合到细菌DNA中，随着染色体DNA的复制而复制；含有5种内切酶的单一切点；携带有抗四环素和抗氨苄青霉素的基因。同学们在学习中，需要注意的是不要把质粒与运载体等同。

（三）基因工程操作的基本步骤

1、提取目的基因

　　取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段称为“目的基因”。获得途径常有两条：一是直接分离法，又叫“鸟枪法”。用DNA限制性内切酶从供体细胞的DNA中将目的基因分离出。优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。另一途径是人工合成法：一是反转录法，以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成单链DNA再合成双链DNA；二是逆推法，以已知氨基酸序列，推出mRNA序列，再推出目的基因序列，然后人工合成。

2、目的基因与运载体结合

　　这个过程即为体外重组DNA的过程。首先选择目的基因所适合的运载工具，如质粒、病毒等，然后用同一种限制酶分别切割运载体和目的基因，使其产生相同的黏性末端，再加入适量的DNA连接酶，在生物体外将目的基因的DNA与运载体的DNA结合起来，形成重组DNA（或重组质粒）

3、将目的基因导入受体细胞

　　将重组的DNA杂合分子，借鉴细菌或病毒侵染细菌的途径，转移到选定的生物体细胞中，使重组的DNA在受体细胞中复制、转录、翻译得以表达。把目的基因装在运载体上并通过运载体将目的基因运到受体细胞的这一过程，在一般情况下，转化成功率仅为百分之一。为此遗传工程师们创造了低温条件下用氯化钙处理受体细胞和增加重组DNA浓度的办法来提高转化率。采用氯化钙化处理后，能增大受体细胞的细胞壁透性，从而使杂种DNA分子更容易进入。另外也可用基因枪法、激光微束穿孔法、显微注射法等方法直接将目的基因转入受体细胞（如受精卵细胞）。

4、目的基因的检测和表达

　　目的基因的导入过程是肉眼看不到的，因此，要知道导入是否成功，并把目的基因能表达的受体细胞挑选出来，运载体事先应有特定的标志，若在受体中能找出已转化细胞或个体，即检测到外源DNA所携带的特定遗传信息是否得到了表达，则可据此判断受体细胞是否获得了目的基因。

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