一、实验目的

　　1、初步掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。

　　2、了解叶绿体的结构以及其中的光合色素，理解其中的色素与光合作用的关系。

　　3、理解结构与功能相适应的规律。

二、实验原理

　　叶绿体中色素提取的原理是：由于光合色素位于叶绿体中的片层结构上，要把它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，同时还要加入丙酮使色素溶解，来提取各种色素，另外还要加碳酸钙以保护叶绿体中的色素，原因是加碳酸钙以调节液体的pH，防止叶绿素被破坏。叶绿体中的色素溶解于有机溶剂如酒精或丙酮（相似相溶），形成色素液。分离的原理是：四种色素在层析液中溶解度不同，因而随层析液在滤纸上扩散的速度不同，四种色素随层析液在滤纸条上的扩散速度不同，其中胡萝卜素在丙酮中的溶解度最高，扩散速度最快，叶黄素和叶绿素a次之，叶绿素b溶解度最低，扩散得最慢，根据此原理使各色素分离开来。

三、实验材料

　　本实验材料最好不选择菠菜叶，由于菠菜叶含水分多，实验效果不太明显。可选用大叶黄杨，因为它的叶片含水量相对较少，颜色深绿，含色素较多，层析效果更明显。

四、试剂与仪器

　　烧杯（100mL）、研钵、漏斗、尼龙布、毛细吸管、剪刀、小试管、培养皿、角匙、量筒（10mL）、天平、丙酮、层析液、二氧化硅、碳酸钙。

五、实验方法与步骤

　　（1）提取绿叶中的色素——研磨法

　　称取、剪碎5g叶片，放入研钵中。加入少许二氧化硅、碳酸钙、5mL丙酮。快速、充分研磨。

　　根据叶绿体中的色素在有机溶剂（乙醇、丙酮等）中溶解的特性，用丙酮可将色素从叶片中提取出来（若用95％的酒精作溶剂，则应向色素提取液中加入无水碳酸钠，除去色素提取液中的水分。若用丙酮作溶剂，则用量不宜过多，以2～5mL为宜，过多会影响色素浓度，过少不易过滤），过滤后收集滤液（将研磨液迅速倒入基部已放—块单层尼龙布的漏斗中过滤），将滤液收集到小试管中，及时用棉塞将试管塞紧备用。注：也可以不过滤，加入适量的丙酮把叶子研磨成糊糊状，再用载玻片（或木工用的竹笔）的一端蘸取研磨液直接点样即可。

　　（2）制备滤纸条

　　将干燥过的定性滤纸剪成6 cm×l cm的条，一端剪去两角，距该端lcm处用铅笔画一条极细的横线。用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀画一条细而直的滤液线，待干燥后再重复画2～3次（次数越多色素越多）。

　　（3）色素分离------纸层析法

　　将干燥后的滤纸条画线一端朝下放入有少许 （2～3mL）层析液的烧杯中，盖上培养皿。

　　（4）观察层析后，取出滤纸条，烘干后观察色素分离情况。

　　（5）整理、洗手。

六、注意事项

　　（1）取材时要选取新鲜的颜色较深的叶片，以便使滤液中含较多的色素。

　　（2）研磨时加入二氧化硅的目的是为了研磨得充分，更有效地破坏细胞结构；但二氧化硅是特别细的白色粉末，再加上不好控制用量，往往过量，使滤液中含有较多的二氧化硅，导致滤液颜色变浅。实验证明，滤液中杂质越多，实验现象越不明显，改用白细河沙（洗净干燥后用）代替二氧化硅粉末，这样研磨更充分，滤液中减少了杂质的含量，颜色变得深绿，实验效果明显。加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。因为叶绿素分子结构中含有一个镁原子，当细胞破裂时，细胞液内有机酸中的氢可取代镁原子而成为褐色的去镁叶绿素，碳酸钙可中和有机酸以防止去镁反应的发生。

　　（3）研磨要迅速、充分。一是因为丙酮容易挥发；二是为了使叶绿体完全破裂，从而能提取较多的色素；三是叶绿素极不稳定，能被活细胞中的叶绿素酶水解而破坏。

　　（4）滤液收集后，要及时用棉塞将试管口塞紧。

　　（5）制备滤纸条时，要将滤纸条的一端剪去两角，这样可以使色素在滤纸条上扩散均匀，便于观察实验结果。

　　（6）画线时，一定要细并且直，这样可以防止色素带重叠，使色素分子均匀分布在一条直线上，做到扩散起点一致。重复画2～3次，是为了增加滤液细线上的色素分子数量，使实验效果更加明显。

　　（7）分离色素时，一定不要让滤纸条上的滤液细线接触到层析液，这是因为色素易溶解于层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。

七、实验小结

　　本实验通过叶绿体中色素的提取和分离实验，证明了叶绿体色素的种类、颜色和各色素带的位置，结合其作用综合如下表。

叶绿体中色素的对比

八、实验例题讲解

例1、对绿色植物光合作用最有效的一组光是（ ）

A．红光和黄绿光　　B．黄光和蓝紫光　　C．红光和橙光　　D．红光和蓝紫光

解析：

　　绿色植物叶绿体中的色素分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，叶绿素主要吸收可见太阳光的红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光，也就是说红光和蓝紫光对光合作用最有用。

答案：D

例2、将提取的叶绿体色素滤液装入试管中，让一束白光穿过该滤液后经三棱镜对光进行色散，哪条光谱的颜色明显减弱（ ）

A．绿光　　　　B．黄光　　　　C．红橙光、蓝紫光　　　　D．黄光

解析：

　　关键是白光穿过叶绿体色素滤液后，叶绿体中的色素吸收何种光谱，课本告诉我们叶绿素吸收红橙光和蓝紫光，胡萝卜素吸收蓝紫光，则红橙光和蓝紫光由于被色素吸收而变弱。

答案：C

总结：对叶绿素的光学性质的认识是本题的解题关键。

例3、某同学在做“叶绿体中色素的提取和分离”实验时，操作情况如下所述，结果实验失败，请指出其错误所在：

　　（1）将5g新鲜完整的菠菜叶放入研钵中，加入丙酮、石英砂、碳酸钙以后，迅速研磨，然后按要求过滤。

　　（2）用毛细吸管吸取少量滤液。沿铅笔线处小心均匀的画上一条滤液细线，并连续迅速地重复画2～3次。

　　（3）把画好细线的滤纸条插入层析液中，并不断摇晃，以求加快色素在滤纸条上的扩散。

解析：

　　对新鲜绿叶应除去粗的叶脉后再行称重，以增加单位重量叶片所含的叶绿素；此外，还需将叶尽量剪碎，提高研磨效果；画滤液线时，须待所画的滤液线干燥后再重复画线，否则会造成画线过粗和色素浓度低的情况；滤纸条插入层析液后，由于摇晃，使层析液接触滤液线而将色素溶解，会严重影响实验结果。

答案：（1）未去除粗叶脉和将叶剪碎，降低了叶绿素的提取率；（2）上一次滤液细线未干燥，即画下一次线，使滤液线过粗或线上色素量较低；（3）由于摇晃，层析液接触滤液线，溶解了色素。

九、相关实验练习题

1、从叶绿体中提取色素，选取的最佳叶片应是（ ）

A．肥嫩多汁　　　　　　　　　　　　　　B．革质叶片

C．刚刚长出来的小嫩叶　　　　　　　　　D．鲜嫩，色浓绿的叶片

2、叶绿体的色素能够在滤纸上彼此分离开的原因是（ ）

A．色素提取液中的不同色素已经分层

B．阳光的照射使各种色素能彼此分开

C．滤纸对各种色素的吸附力不同

D．丙酮使色素溶解并彼此分离的扩散速度不同

3、下列关于“叶绿体色素提取和分离”的实验描述中，不属于实验要求的是（ ）

A．提取高等植物叶绿体中的色素　　　　　B．用纸层析法分离色素

C．了解各种色素的吸收光谱　　　　　　　D．验证叶绿体中所含色素的种类

4、在叶绿体色素的提取实验中，研磨绿叶时要加入丙酮，其目的是（ ）

A．防止叶绿素被破坏　　　　　　　　　　B．使叶片充分磨碎

C．使各种色素充分溶解在丙酮里　　　　　D．为了使叶绿素溶解在丙酮里

5、下列各项液体，可作为色素溶剂的是（ ）

A．水　　　　　B．氯化氢　　　　　C．乙醇　　　　　D．草酸

6、在进行叶绿素提取和分离的实验时，不能让层析液没及滤液细线的原因是（ ）

A．滤纸条上几种色素会扩散不均匀而影响结果

B．滤纸条上滤液细线会变粗而使色素太分散

C．色素会溶解在层析液中而使结果不明显

D．滤纸条上的几种色素会混合起来

7、纸层析法分离叶绿体色素时，滤纸条上最上端的色素名称和颜色分别是（ ）

A．叶绿素a、蓝绿色　　　　　　　　　B．叶绿素b、黄绿色

C．胡萝卜素、橙黄色　　　　　　　　　D．叶黄素、黄色

8、在研磨绿叶时，下列哪种物质不需加入（ ）

A．丙酮　　　　　B．层析液　　　　　C．碳酸钙　　　　　D．二氧化硅

9、下列中，哪组是影响叶绿体色素分离效果的关键步骤（ ）

　①选植物绿叶　　　②研磨　　　③过滤　　　④画滤液细线

　⑤层析时不要让滤液细线触及层析液　　　　　⑥观察色素带

A．①②⑤　　　　　B．①②③　　　　　C．②③④　　　　　D．②③⑥

10、在圆形滤纸的中央，滴上叶绿体的色素滤液进行色素分离，可看到近似同心环状的四个色素圈，排列在最外的一个呈（ ）

A．蓝绿色　　　　　B．黄绿色　　　　　C．黄色　　　　　D．橙黄色

11、叶绿体色素随着层析液在滤纸上扩散，其中扩散得最远的是（ ）

A．胡萝卜素　　　　B．叶黄素　　　　　C．叶绿素a　　　　D．叶绿素b

12、经纸层析后，滤纸条上最窄的色素带（用新鲜菠菜叶作材料）是（ ）

A．叶绿素a　　　　B．叶绿素b　　　　　C．叶黄素　　　　　D．胡萝卜素

13、叶绿体中色素的提取和分离实验主要证明了（ ）

A．色素分布在叶绿体片层结构薄膜上　　　　　　B．叶绿素含量是类胡萝卜素的四倍

C．叶绿体中色素的种类和各种色素的颜色　　　　D．四种色素扩散速度不同

14、提取和分离叶绿体中色素的正确顺序应该是（ ）

A．进行纸层析→制取滤液→在滤纸条上画线→将实验材料研磨

B．制取滤液→进行纸层析→在滤纸条上画线→制取滤液→再画线

C．将实验材料剪碎、研磨→在滤纸条上画线→制取滤液→进行纸层析

D．将实验材料剪碎、研磨→制取滤液→在滤纸条上画线→进行纸层析

15、某同学做“叶绿体中色素的提取和分离”实验，在下列操作中若有失误，请在失误处画线并更正：

　　①将5克绿叶片剪碎放研钵中，加入少许二氧化硅和碳酸钙，再加2mL石油醚，并迅速充分研磨。

　　②在预备好的滤纸条上，距剪去两角1厘米处用钢笔画横线。

　　③用毛细管吸取少量滤液，沿横线处均匀地画出一条滤液细线，紧接重复划2～3次。

　　④将层析液倒人烧杯中，然后将滤纸条画有细线的一端朝下，轻轻插入到层析液中，注意层析液最好没及滤纸条上滤液细线。

更正的内容为：

　　① ______________________________________________________。

　　② _______________________________________________________。

　　③ _______________________________________________________。

　　④ _______________________________________________________。

　　若用叶色很浅的菠菜心叶做此实验，效果很差的原因在于___________；若用菠菜的老黄叶作实验材料，经层析后在滤纸条上分离出来了色素带，但是色素带存在缺陷，缺陷是_________________。

[答案]

16、把带有叶子的枝条插入水中，在暗室里放置两天。用打孔器在取下的叶子上打孔，打成圆片，其中一部分圆片叶的背面放入水中，另—一部分放入5％的葡萄糖溶液中，并让它的皮层漂浮在上面，在暗室放置两天。然后，把这些叶片放在热水中，几分钟之后，放入温热到70℃的90%的乙醇中浸泡1h以上。接着把这些叶片放入水中而变得柔软，再浸入稀碘液（碘—碘化钾溶液）中后，用水洗掉碘液，观察叶片颜色变化时，浮在水面上的叶子呈白色或者浅黄褐色，但浮在葡萄糖液上的叶片就染成了黑紫色。

问：在上述实验中浮在葡萄糖液上的叶片，遇到碘液而显示黑紫色的原因是什么?从下列的①—⑦的叙述里，选出正确的答案，用它的号码表示出来。

　　①在开始实验前，通常叶子里已经贮藏了淀粉，由于碘液跟它作用而染上了颜色。

　　②在开始实验前，因为通常叶子里已经贮存了葡萄糖，在实验过程中，它转变成淀粉而被碘液染色。

　　③在实验过程中，叶片里发生了碳酸同化，其结果，生成淀粉被碘液染色。

　　④在实验过程中，叶片内部渗透的葡萄糖与叶绿素结合生成淀粉而被碘液染色。

　　⑤在实验过程中，在叶片内部渗透的葡萄糖生成淀粉而被碘液染色。

　　⑥在实验过程中，渗透到叶片内部的葡萄糖被碘液染色。

　　⑦在实验过程中，使用渗透到叶片内部的葡萄糖而不引起细胞呼吸，结果生成葡萄糖的分解物被碘液染色。

[答案]

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