[实验目的]
1、了解生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的存在。
2、初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。
[实验原理]
某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应，对生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质进行鉴定。
1、还原糖的鉴定原理
生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。前三种糖的分子内都含有游离的具有还原性的半缩醛羟基，因此叫做还原性糖；蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。实际上本实验中，用斐林试剂只能检验生物组织中可溶性的还原糖存在与否，而不能鉴定可溶性的非还原性糖。
斐林试剂由氢氧化钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液和硫酸铜的质量浓度为0.05g/mL的溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身氧化成葡萄糖酸。其反应式如下：
CH20H-(CHOH)4-CHO
+ 2Cu(OH)2→CH20H-(CHOH)4-COOH
+ Cu20↓ +
2H20
用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。
2、脂肪的鉴定原理
鉴定生物组织中是否含有脂肪时，可用苏丹Ⅲ染液、苏丹Ⅳ染液。因为苏丹Ⅲ染液可将脂肪染成橘黄色，苏丹Ⅳ染液可将脂肪染成红色。
3、蛋白质的鉴定原理
鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂。双缩脲试剂的成分是氢氧化钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液和硫酸铜的质量浓度为0.01g/mL的溶液。在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应，从而用来鉴定蛋白质的存在。
[实验材料、试剂和仪器]
1、可溶性还原糖的鉴定
还原糖的含量、生物组织中有无色素是影响实验结果及其观察的最重要因素。因此要选用可溶性还原糖含量高、白色或近于白色的植物组织，其中以苹果、梨最好。也可用白色的甘蓝叶、白萝卜替代（不能选西瓜）。经实验比较，颜色反应的明显程度，依次为苹果、梨、白色甘蓝叶、白萝卜。我校用的是梨，苹果容易被氧化变色。
2、脂肪的鉴定实验
所用材料一要脂肪含量高，二要有—定大小才能做徒手切片，花生种子符合该实验的要求。将花生种子浸泡3～4h，使其变软，有利于切成薄片；但浸泡时间也不宜过长，否则组织太软，切下的薄片不易成形。
3、蛋白质的鉴定
一般选用浸泡1～2d的富含蛋白质的大豆种子或用鸡蛋清。为节约时间，我校用的是稀释20倍的鸡蛋清。
4、试剂和仪器
（1）试剂
①斐林试剂 甲液（0.1g/mL的NaOH溶液）NaOH 10g
加水至 100mL
乙液（0.05g/mL的CuS04溶液） CuSO4 5g
加水至 100mL
②苏丹Ⅲ染液 苏丹Ⅲ干粉 0.1g
95％酒精 lOOmL
③双缩脲试剂 A液（0.1g/mL的NaOH溶液）NaOH 10g
加水至 100mL
B液（0.01g/mL的CuS04溶液）CuS04 1g
加水至 100mL
④体积分数为50％的酒精溶液
（2）仪器：剪刀，解剖剪，双面刀片，试管，试管架，试管夹，大、小烧杯，滴管，小量筒，玻璃漏斗，酒精灯，三角架，石棉网，火柴，研钵，石英砂，纱布，载玻片，盖玻片，毛笔，吸水纸，显微镜。
[实验方法与步骤]
1、可溶性还原糖的鉴定
①制备组织样液：将苹果洗净、去皮、切块→取5g加少许石英砂研磨→加5mL水再研磨→漏斗垫纱布后过滤，得到样液。
②鉴定样液：加2mL样液于试管中→将刚配制的斐林试剂2mL注入试管，振荡混合（这时样液呈淡蓝色） →水浴煮沸2min左右，观察溶液的颜色变化。这时可看到溶液先变为棕色而后变成砖红色。这证明植物细胞中含有可溶性还原糖，如葡萄糖等。
③结论：该溶液颜色变成砖红色，这说明组织样液中的还原糖与斐林试剂发生了反应，从而鉴定苹果组织中有还原糖存在。
2、脂肪的鉴定
①切片制作：取浸泡3～4h的花生种子（蓖麻、大豆、葵花籽均可）。去掉种皮后，用子叶做徒手切片，然后用毛笔挑取最薄的切片置于干净的载玻片上。
②染色：滴苏丹Ⅲ染液2～3滴于花生子叶薄片上→2～3min后，吸去染液→滴体积分数为50％的酒精洗去浮色→吸去多余酒精，再滴1～2滴蒸馏水，盖上盖玻片。
③镜检鉴定：在低倍物镜下观察，找到花生子叶切片的最薄处，移至视野中心→换用高倍物镜观察，调焦至最清晰即转动转换器，让高倍物镜正对着通光孔；将细准焦螺旋轻轻向反时针方向转动，大约转动半圈。可发现细胞内有许多橘黄色圆形小颗粒，这就是脂肪滴（油滴）。若发现观察物外围也有许多橘黄色小颗粒，则是脂肪“跑”出来了。
④结论：该颗粒可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，它是生物组织中的脂肪物质。从而鉴定花生种子（子叶）组织中有脂肪存在。
3、蛋白质的鉴定
①制备样液：浸泡黄豆1～2d→去皮、切成薄片，加少许石英砂及5mL水研磨→漏斗垫上纱布后过滤，得到样液（用蛋清效果亦很好，但注意要稀释10倍以上，否则实验后黏在试管壁上，不易洗净）。
②鉴定：加2mL样液于试管Ⅰ中→加入2mL双缩脲试剂A液摇匀（造成一个碱性环境） →加入双缩脲试剂B液3～4滴，摇匀，注意颜色变化（溶液逐渐变成红紫色）。另加2mL样液于试管Ⅱ中→加入2mL蒸馏水摇匀→无颜色变化，作为对照。
③结论：组织样液加入双缩脲试剂A后，颜色变化为无色，再加双缩脲试剂B后，颜色的变化是紫色。这说明组织样液中含有蛋白质。从而鉴定黄豆组织中或者蛋白稀释液中有蛋白质。
[实验注意事项]
1、本实验成功的关键在于实验材料的选择，为提高实验效果，应根据当地实际情况，精心选择含糖量较高，富含脂肪、蛋白质的生物组织或器官作为实验材料。选好实验材料，实验成功了—半。比如材料中含有的必须是可溶性还原糖，蔗糖不是还原糖不能用；一般淀粉又是不溶性糖且无还原性也不能用。因此，要充分理解教材中选用特定材料的意图。
2、本实验的三类有机物的鉴定，均依据特定的颜色反应。所以在实验中应特别注意观察鉴定试剂加入前后的颜色变化，加深印象并做好记录。
3、在对可溶性还原糖鉴定的过程中，使用的斐林试剂要现配现用，混合均匀后一次加入（在实验中改用班氏试剂更为简便）。在水浴加热时，试管底部不要触及烧杯底部，以防止试管受热不均匀而爆裂；加热时，试管口也不要朝向自己或他人，防止沸腾的溶液冲出试管造成烫伤。
4、在对脂肪进行鉴定时，切出符合要求的薄切片是实验结果能否满意的关键。要多按教材要求练习徒手切片技术（特别注意切片时的安全）。该实验是把化学反应和显微镜观察结合起来的实验，叫显微化学鉴定。
5、在对蛋白质进行鉴定时，若使用蛋清，必须按要求稀释。实验样液要留出一份作为对照，便于最后进行比较。
6、实验中各试剂的使用不可弄混，要牢记不同试剂的鉴定对象。
[实验结果与讨论]
1、如果注意了材料的选择和实验要求，本实验颜色效果会十分明显。
2、前面提到斐林试剂要现配现用，否则实验难以得到满意结果。这是因为此反应利用的是斐林试剂中的Cu(OH)2产物作为弱氧化剂参与与还原糖的反应。而我们知道，Cu(OH)2是一种不溶于水的物质，放置过久沉淀过多则不利于反应，而班氏试剂是斐林试剂的改良，它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，使之稳定溶解，灵敏度高且可以长期使用，故更为简便。
